Kaip mokslininkai konstravo koronę. M.Supotnickio knygos 2 ištrauka.

 

M.Supotnickio knygos: „Covid-19. Sunkus egzaminas žmonijai.“ Vertimas, 1 ištrauka. 

http://lebionka.blogspot.com/2022/01/msupotnickio-knyga-covid-19-sunkus.html

Psl 45-48. http://rpmp.ru/book/38/COVID-19.pdf

 

Mokslininkai Follis K.E. ir kt. (2006) iš Montanos universiteto (Misula, JAV) pastebėjo, kad furinas ir į furiną panašios ląstelių proteazės neturi SARS-CoV skaldymo vietos, kas sąlygoja nepilną jo skaldymą sąveikaujant su receptoriu ir, iš to seka, nepanaudojimą viso viruso patogeninio potencialo. Šis atradimas prieštaravo tuo metu egzistavusiam supratimui apie ypatingą vaidmenį proteolitinio brendimo struktūroje ir funkcijoje kitų I klasės glikoproteinų, esančių viruso apvalkalų struktūroje. S-baltymo skaldymas ląstelių proteazėmis reikalingas užtikrinimui potencialo susiliejimo apvalkalo glikoproteidų retrovirusų, ortomiksovirusų, paramiksovirusų, filovirusų, arenavirusų ir daugelio koronavirusų (MHV, paukščių koronavirusai, CoV ОС43), nes iš pradžių jie sintezuojami kaip neaktyvūs pirmtakai. Proteolitinis suskaldymas jiems būtinas subrendimui ir pilnam funkciniam aktyvumui. Po sekančios subrendusio I klasės glikoprotaino apvalkalo aktyvacijos jam susirišant su receptoriu/ar dėl žemo endosominio pH šie kompleksai patiria gilią struktūrinę reorganizaciją, ko pasekoje susidaro stabilios segtukų pavidalo struktūros, sąlygojančios efektyvų susiliejimą virusinių ir ląstelių membranų (Eckert D.M., Kim P.S., 2001).

Su pagalba algoritmo МАХНОМ, naudojamo išlyginimui sekų spėjamos srities susijungimo S1-S2 koronaviruso S-glikoproteino, К. Е. Follis et al. (2006) aptiko liekanas furino saito glikoproteinuose SARS-CoV, CoV 229Е ir NL63, dingusias dėl spontaninių delecijų. Apie kažkada egzistavusį saitą, jautrų proteazei, signalizavo vienintelis argininas (R) padėtyje 667 S-glikoproteino SARS-CoV.

Įvedimas sintetinės sekos atpažinimo furino SLLR R667, t. y. numatomą sritį susijungimo S1-S2, padaro galimu efektyvų skėlimą S-glikoproteino su susidarymu diskretiškų subvienetų S1 ir S2 ir ženkliai padidino sugebėjimą spyglių komplekso tarpininkauti susijungiant ląstelėms, t. y. formuoti sinticijas.

Nebuvimas furino saito pas SARS-CoV, ir be jo sąlygojančių letalią baigtį beveik pas dešimtadalį susirgusių atipine pneumonija, sukėlė susidomėjimą pas japonų mokslininkus. Watanabe R. et al. (2008) iš National Institute of Infectious Diseases (Tokyo, Japan) įvedė furininę skėlimo seką į S-baltymą nuo 798 iki 801 amino rūgšties ir nustatė, kas S-baltymas dabar skeliamas ekspresuojantis jam ant ląstelės paviršiaus ir indukavo susiliejimą ląstelių be veikimo tripsinu. Be to, jie aptiko, kad pseudotipuotas virusas, nešantis suskaldytą S-baltymą, užkrečia ląsteles esant lizocomatropiniam agentui, o taip pat proteazės inhibitoriui, kurie abu paprastai blokuoja prasiskverbimą SARS-CoV į ląstelę per endosomas. Watanabe R. et al. (2008) rezultatai parodė, kad insercija furino saito į S-baltymą SARS-CoV leidžia virusui prasiskverbti į ląstelę tiesiai nuo jos paviršiaus.

Atradimas SARS-tapačių CoV (SL-CoV), identiškų savo genomo organizacija su SARS-CoV, bet skirtingų pagal susirišimą su АСЕ2, iškėlė tyrinėtojams klausimą apie tai, kokiu mastu yra neįveikiamas tokiems virusams tarprūšinis barjeras tarp žmonių ir šikšnosparnių. Kitais žodžiais, ar gali SARS-panašūs CoV žinduolių dėka atsitiktinės rekombinacijos su genomais kitų koronavirusų įgyti gebėjimą sukelti infekcijos procesą pas žmones. Pirmas bandymas atsakyti į šį klausimą pamėgino Shi Zhengli grupė. Tam žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) pagrindu jų buvo sukonstruota pseudovirusinė sistema su ląstelių linijomis, ekspresuojančiomis molekules АСЕ2 žmogaus, civetės arba pasaganosio šikšnosparnio. Pseudovirusai turėjo pilno dydžio S-baltymą SL-CoV и SARS-CoV ir seriją S-chimerų, turinčių insercijas įvairų sekų S-baltymo SARS-CoV į pagrindinę grandinę S-baltymo SL-CoV. Jie parodė, kad S-baltymas SLCoV negali panaudoti АСЕ2 skirtingų rūšių įvedimui į ląsteles. S-baltymas SARS-CoV taip pat gali surišti molekulę ACE2 pasaganosio šikšnosparnio Rhinolophus pearsonii. Tačiau, kada RBD S-baltymo SL-CoV buvo pakeistas į RBD S-baltymo iš SARS-CoV, hibridinis S-baltymas įgijo sugebėjimą naudoti žmogaus АСЕ2 įėjimui į ląstekę (nors ir su skirtingu efektyvumu pas skirtingas konstrukcijas), kas reiškė struktūrinį ir funkcinį panašumą S-baltymo SL-CoV su S-baltymu SARS-CoV. Šie rezultatai rodo, kad, nors tyrimo metu šikšnosparniuose rastas SL-CoV vargu ar gali užkrėsti žmones, dar reikia išsiaiškinti, ar jie gali naudoti kitas tam tikrų žmogaus ląstelių tipų paviršiaus molekules. Taip pat gali būti, kad šie virusai gali tapti užkrečiami žmogui, jei jų N-galinė seka pakinta, pavyzdžiui, rekombinuojant su kitais CoV, o tai savo ruožtu gali lemti produktyvią sąveiką su ACE2 ar kitais žmogaus ląstelių paviršiaus baltymais (Ren W. ir kt., 2008).

Ralpho Barricko grupė, priešingai nei Shi Zhengli grupė, virusų ir receptorių sąveikos tyrimams nenaudojo pseudotipinių virusų. Jie manė, kad ši sistema yra saugi, bet pernelyg dirbtinė. Gautus rezultatus sunku ekstrapoliuoti į tikrąjį infekcijos procesą, nes iš esmės negalima užtikrinti teisingos glikoproteino S struktūros raiškos virionuose. Todėl, naudodami sintetinės biologijos metodus ir atvirkštinės genetikos sistemą (aptarta pirmiau, kuriant TGEV ir MHV), jie gavo seriją izogeninių padermių, atitinkančių palmių civetų ir jenotų padermes, taip pat izoliatus, apimančius ankstyvąjį, vidurinį ir vėlyvąjį SARS-CoV epidemijos etapus. In vitro sąlygomis susintetinti rekombinantiniai virusai veiksmingai replikavosi ląstelių kultūroje ir pasižymėjo skirtingu jautrumu antikūnų neutralizacijai. Žmogaus, bet ne zoonozinio viruso variantai veiksmingai replikavosi žmogaus kvėpavimo takų epitelio kultūrose, patvirtindami ankstesnes hipotezes, kad zoonoziniai izoliatai yra mažiau patogeniški žmonėms, bet gali virsti labai patogeniškais štamais. Visi dirbtiniai virusai permisinėse ląstelių linijose dauginosi efektyviai. Sunkus plaučių pažeidimas, pasireiškiantis difuziniu alveolių pažeidimu, hialininių membranų formavimusi, alveolitu ir mirtimi, buvo pastebėtas 12 mėnesių pelėms, intranazaliai užsikrėtusioms palmių civetų paderme HC/SZ/61/03 arba SARS-CoV variantu GZ02, išskirtu ankstyvuoju epidemijos etapu. Giminingos linijos štamų SARS-CoV vidurinės ir vėlyvos epidemijos stadijų arba išskyrimą iš jenotų pažeistų plaučių nesukeldavo (Rockс В. et al, 2007).

Ši mokslininkų grupė sintezavo SARS-panašų CoV dydžiu 29,7 tūkst. n.p. (Bat-SCoV), tikėtina, kaip jie tuomet skaitė, pirmtakas epideminio SARS-CoV. Tyrimų pradžiai jų tyrimai buvo identifikuoti keturi Bat-SCoV (HKU3-1, HKU3-2, HKU3-3 и RP3), bet nei vienas iš jų nebuvo išskirtas kultūroje. Šių virusų užkrečiamumas buvo hipotetinis, nes jų genominės RNR sekos buvo gautos OT-PCR sekoskaitos būdu iš šikšnosparnių išmatų arba tiesiosios žarnos tepinėlių paėmus viruso genetinės medžiagos mėginius. Ralfo Bariko grupė, naudodama konsensuso inžineriją, susintetino anksčiau neegzistavusio viruso seką. Tyrėjai pagal keturias sekas Bat-SCoV, paimtas iš bazės GenBank (prieigos numeris FJ211859), suprojektavo konsensinę koronaviruso seką ir „suskaldė“ ją į kDNR fragmentus su sujungimo taškais, tiksliai suderinti su egzistuojančia sistema atvirkštinės genetikos SARS-CoV. Viruso struktūroje buvo padarytas pakeitimas domeno surišimo receptoriaus Bat-SCoV Spike (RBD) ant SARS-CoV RBD (Bat-SRBD). Buvo panaudoti nustatyti ir funkcionaliniai 5'-UTR SARS-CoV ir reguliatorinės transkripcijos sekos, nes 5'-UTR Bat-SCoV buvo nepilnos. Sintezuoti fragmentai genominės kDNR įstatė į plazmidinius vektorius ir surinko į pilno dydžio kDNR. Ją transkribavo in vitro ir buvo gautas RNR koronavirusas, pažymėtas Bat-SRBD. Jis įgijo gebėjimą infekuoti pelės ląstelių kultūrą (Becker М.М. et al., 2008).

Matomai, atėjo laikas apjungti pastangas abiejų grupių. Jų bendrame darbe, turinčiame, autorių tvirtinimu, tikslas „prognozuoti ir pasirengti būsimiems atsirandantiems virusams“, atvirkštinės genetikos metodu buvo sukurtas naujas virusas - SHC014-MA15, sugebantis replikuotis žmogaus ir žinduolių kvėpavimo takuose. Tuo tikslu į nukleotidų seką S1 subvieneto, cirkuliuojančią tarp šikšnosparnių koronaviruso SHC014 – artimiausio „giminaičio“ SARS-CoV, ir nepasireiškusio kaip žmogaus patogeno dėl skirtumo 14 amino rūgščių spiglyje, susirišančiame su žmogaus АСЕ2, buvo padaryti taškiniai pakitimai (23). Tyrėjai pakeitė geno nukleotidų seką, koduojančią subvienetą S1 pas SHC014, į analoginę su SARS-CoV. Likę genai, t. y. tie, kurie sąlygoja formavimą transkripcinį kompleksą virusinės replikacijos ir surinkimą jo dalelių ląstelėje, nebuvo pakeisti (24). Naujasis chimerinis į SARS panašus koronavirusas pavadintas SHC014-MA15.

Kaip ir SARS infekavimui plaučių epitelio ląstelių žmogaus, civetos ir šikšnosparnio, jis gali naudoti АСЕ2 kaip receptorių-taikinį ar jo ortologus ir replikuotis juose iki aukštų titrų, sulyginamų su tokiais pas gamtinį kamieną SARS-CoV Urbani, turintis ankstesnius SHC014 genus.

Eksperimentai in vivo parodė replikaciją chimerinio viruso plaučiuose eksperimentinėse pelėse su išreikštu pataloginiu procesu (piešinys 1.10) (25).

Piešinys 1.10 — Chimerinis virusas SHC014-MA15, sugebantis replikuotis kvėpavimo takuose žmogaus ir žinduolių, turinčių receptorių АСЕ2 arba jo ortologus. Genomo sekos ir amino rūgščių sekos domenų S1 spyglio subvienetų, reprezentatyvinių CoV, buvo užkrautos iš Genbank arba Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC). Virusinis genomas sintezuotas iš šešių tarpinių segmentų kDNR (pažymėtų kaip SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E ir SHC014F), flankuotų unikaliais restriktazės Bgl II saitais, kurie įgalino atlikti surinkimą pilno dydžio kDNR. Nauja chimera pasirodė virulentiškesne net žmogaus ląstelėse, negu pradinis virusas - SHC014 (Menachery V.D. et al., 2015) 

 

Tačiau dėl bendro S1 subvienetų gebėjimo atpažinti žmogaus ACE2 receptorių abiejų virusų panašumas baigėsi (26). SHC014 virusas pasižymėjo savitu patogeniniu potencialu, kuris iki eksperimentų nebuvo įtariamas, pavyzdžiui, gebėjimu įveikti dirbtinai sukeltą imunitetą.

Tyrėjai bandė in vitro sąlygomis nustatyti plataus spektro monokloninių antikūnų (mAb) (109.8, SHC014-MA15, 230.15 ir 227.14)27 , kurie pasižymėjo geru neutralizuojančiu poveikiu prieš SARS-CoV, neutralizuojantį veiksmingumą prieš SHC014-MA15. Šių antikūnų poveikis SHC014-MA15 replikacijai buvo nereikšmingas, o SARS-CoV Urbani replikaciją jie slopino esant santykinai nedidelėms koncentracijoms. Tik naudojant didelės koncentracijos (10 µg/ml) mAb 109.8, in vitro sąlygomis pavyko pasiekti 50 % SHC014-MA15 neutralizaciją (Menachery V.D. ir kt., 2015).

Nuorodos:

(23) Žr. T. Sheahan et al. (2008). (24) Darbas atliekamas biologinės saugos lygio BSL3 sąlygomis. Taikoma mikroorganizmams, kurie gali sukelti potencialiai mirtiną ligą įkvėpus aerozolių. Daugiau informacijos apie biologinės saugos lygius žr. https://en.wikipedia.Org/wiki/Biosafety_level#Biosafety_level_3(žiūrėta 2020 03 04). (25) 2015 m. pabaigoje atliktas darbas sukėlė diskusijas dėl aprašytų eksperimentų saugumo. Paryžiaus Pastero instituto virusologas Simonas Wain-Hobsonas atsakė, kad mokslininkai sukūrė naują virusą, kuris "nepaprastai gerai auga" žmogaus ląstelėse. "Jei virusas prasiveržia, niekas negali nuspėti, kokia bus jo trajektorija." Žr. https://www.nature.com/news/engineered-bat-virus-stirs-debate-over-risky-research-1.18787 (žiūrėta 2020 03 01). Dar mažiau patikima "numatyti trajektoriją", jei tokie eksperimentai neatliekami. Tačiau Kinijos virusologijos centro Vuchane dalyvavimas šiuose tyrimuose JAV sukėlė sąmokslo teoriją, kad SARS-CoV-2 sukūrė kinų mokslininkai ir jis išplito po pasaulį "pabėgęs" iš Vuchano laboratorijos. Pirmasis šią "teoriją" išdėstęs tviterio įrašas anglų kalba JAV socialinėje žiniasklaidoje buvo paskelbtas 2020 01 20. Žr. https://www.washingtonpost.com/outlook/2020/04/02/yes-russia-spreads-coronaviruslies-they-were-made-america/(žiūrėta 2020 04 02). (26) Daugiau informacijos apie baltymo S struktūrą, funkciją ir evoliuciją žr. Li (2016)