Pernai Rusijoje pasirodė medicinos dr. pulkininko M.V.Supotnickio monografija „Covid-19. Sunkus egzaminas žmonijai“. Knyga Rusijoje tapo bestseleriu ir pirmas knygos tiražas buvo nedelsiant išpirktas. Šios knygos tekstas čia: http://rpmp.ru/book/38/COVID-19.pdf
Aš nutariau nuodugniai susipažinti su šia knyga, kai ką išversti į lietuvių kalbą. Mano tikslas, kad būtų kuo mažiau „tikinčių mokslu“ ir "duomenų mokslininkais.“
M.V.Supotnickis COVID-19 sunkus egzaminas žmonijai (2021)
Skyriaus „Koronavirusų biologija“ turinys (14 psl.):
Taksonomija ir koronavirusų kilmė (14). koronaviruso genomas (24). koronaviruso genomo plastiškumas (36). Dirbtinis koronavirusų genomo keitimas (41). Sąveika su žmogaus genomu (54). Sunkių koronavirusinių infekcijų (MERS, SARS ir COVID-19) molekulinė patologija (56). Ūmaus kvėpavimo nepakankamumo atsiradimas dėl tiesioginio viruso poveikio (60). Antikūnų prieš infekuojantį viruso S baltymą sukeltas ūmus plaučių pažeidimas (65). Pavojingų koronavirusinių infekcijų neurobiologija (66). Kraujagyslių patologija koronavirusinės infekcijos atveju (72). Imuninės ir autoimuninės reakcijos, atsirandančios koronavirusinės infekcijos metu (78). Imuninis atsakas į koronavirusus (79). Patogeninis praimingas (93). Specifinis spyglio baltymo toksiškumas (99). COVID-19 vakcinos sukeltas mimikrijos sindromas (107). Galimas ryšys su prionų ligomis ir neurodegeneracija (108). Koronavirusų išlikimas aplinkoje ir aerozolio būsenoje (109)
Koronavirusai (CoVs) priklauso didelei viengrandinių RNR-virusų šeimai, kurie gali būti išskirti iš įvairių gyvūnų rūšių ir žmonių. Jie sukelia žarnyno ir kvėpavimo takų ligas. Morfologiškai koronavirusai yra sferinės dalelės, kurių dydis yra yra 80-120 nm skersmens sferinės dalelės, turinčios informaciją koduojančią viengubą RNR grandininę (single-stranded RNA, ssRNA), kuri yra 27-32 tūkst.bp ilgio ir sudaro nukleokapsidę. Besiskverbdama į ląstelę viruso RNR išlaiko stabilumą dėl 5'-cap struktūros 5'-gale ir poly-A 3'- gale.
Viruso nukleokapsidę supa baltyminė membrana ir išorinis lipidinis apvalkalas, nuo kurio kyšo spyglių (spikes) ataugos, skirtos sąveikai su ląstelų-taikinių transmembraniniais receptoriais.
Koronavirusai gali peržengti rūšių barjerus ir sukelti sunkias žmonių ligas, pavyzdžiui, MERS, SARS ir COVID-19. Tačiau, skirtingai nuo ankstesnių koronavirusinių infekcijų protrūkių ir epidemijų, COVID-19 pandemija sukėlė gerokai didesnį sergamumą ir gyventojų mirtingumą (Machhi J. ir kt., 2020).
Dirbtinis koronavirusų genomo keitimas (knygos 41 psl.)
Koronavirusai jau daugiau nei 25 metai yra rutininiu genetinės inžinerijos objektu ir prognozuoti sukūrimą naujų „chimerų“ - tas pats ką iš ryto prognozuoti, kad ateis vakaras. Jų sukūrimas tapo kasdienybe dviejų bendradarbiaujančių/konkuruojančių mokslininkų mokyklų: Uhanio virusologijos instituto (Wuhan Institute of Virology, WIV; China) (18) – mokyklos vadovas Zhengli-Li Shi (1964 metų gimimo) ir Šiaurės Karolinos universiteto (University of North Carolina at Chapel Hill, UNC, UNC-Chapel Hill; United States) – vadovas Ralph Steven Baric (1954 metų gimimo) (19). Koronavirusų genomų modifikavimo tyrimai vykdomi su kilniais, viešai skelbiamais tikslais: nustatyti, kas būtent atsakingas už koronavirusų sugebėjimą pereiti iš vienos gyvūnų biologinės rūšies pas kitą; ar jie gali pereiti iš gyvūnų pas žmogų; ar gali plisti aerozoliniu-lašeliniu keliu tarp žmonių ir sukurti išganingą vakciną šiam atvejui ir pan. Žemiau mes keliais štrichais paaiškinsime turimus tyrimus, kuriais siekiama gauti nauja koronavirusų chimeras. Daug išsamiau apie manipuliacijas su koronavirusų genomais galima perskaityti rusų mokslininko Jurijaus Daigino (20) darbe. Pagrindiniu uždaviniu tokių tyrimų 1990-2000 metais buvo išaiškinimas molekulinių mechanizmų sąveikos koronavirusų su atitinkamais jiems šeimininko ląstelės receptoriais. Šio klausimo išsiaiškinimas palengvintų supratimą koronavirusų patogenezės, tačiau tam trukdė nežinojimas virionų surinkimo detalių. Galimybę ištirti vaidmenį atskirų baltymų koronaviruso morfogenezėje suteikė nauja technologija – surinkimas į koronavirusą panašių dalelių (coronavirus-like particles, VLP) iš koekspresuojamų ląstelių kultūroje baltymų M, E ir S be viruso nukleokapsidės dalyvavimo. VLP išsiskirdavo iš ląstelių ir sudarydavo homogenišką populiaciją, morfologiškai nesiskiriančią nuo normalių virionų (Godeke G-J. et al., 1999). M ir E baltymai galėjo savarankiškai suformuoti VLP. Rolė S-baltymo viriono surinkime ir jo dauginimesi liko nesuprantami. S baltymas, kuris pats persikeldavo prie citoplazminės membranos, buvo sulaikomas Goldžio komplekso dėl asociacijos su M baltymu. S-multimerai kažkokiu būdu patekdavo į tuštumas masyvų M (ar M ir E) monomerų, bet jie neįnešdavo ypatingo indėlio į bendrą VLP stabilumą (Opstelten D-J.E. et al., 1995). Tapo akivaizdu, kad S-baltymas, nors ir nereikalingas viruso surinkimui, būtinas jam kažkokiai kitai svarbiai funkcijai, pavyzdžiui, ląstelės infekavimui (KuoL. et al., 2000).
Siekiant įrodyti S-baltymo vaidmenį specifiniame atpažinime receptorių paviršiuje ląstelių-taikinių ir taip įrodyti jo dalyvavimą inicijavime infekcinio proceso, L. Kuo et al. (2000) sukonstravo pelių hepatito viruso mutantą (mouse hepatitis vims, MHV), kurio ektodomenas spyglio glikoproteino (S) baltymas buvo pakeistas S-baltymo stipriai diverguotu ektodomenu S-baltymo kačių infekcinio peritonito viruso (feline infectious peritonitis vims, FIPV). MHV ir FIPV priklauso dviem skirtingoms koronavirusų grupėms ir kiekviena iš jų yra aukšto specifiškumo savo šeimininko rūšiai. S-baltymai MHV ir FIPV (su 1324 ir 1452 amino rūgščių atatinkamai) turi tiktai 26 % bendro amino rūgščių identiškumo, jų didžiausi skirtumai yra kiekvienos molekulės galinių amino rūgščių struktūroje.
Jie atpažįsta skirtingus receptorius: MHV – narių šeimos pelių biliarinių glikoproteinų; FIPV – kačių aminopeptidazę N (fAPN). Gautas gyvybingas chimerinis virusas, pavadintas fMHV, įgijo sugebėjimą įveikti tarprūšinį barjerą – t. y. infekuoti kačių ląsteles, ir tuo pačiu metu jis prarado sugebėjimą infekuoti pelių ląsteles ląstelių kultūroje. Šis reciprokinis rūšinio specifiškumo perjungimas palaikė tyrinėtojų idėją, kad diapazonas koronaviruso ląstelių-šeimininkų apsprendžiamas pirmiausiai lygyje sąveikos tarp S-baltymo ir viruso receptoriaus ant šeimininko ląstelės. Koronaviruso S-baltymas – pagrindinis ir, galimai, vienintelis faktorius jo rūšinio specifiškumo. Tuo pačiu metu autoriai suprato ribotumą panaudojimo sait-specifinės mutagenezės metodo tyrimui genų ekspresijos ir funkcijos genų dėl ypač didelio koronavirusų genomo dydžio. Publikacijos metu jiems nepavyko sukonstruoti pilno dydžio kDNR kloną kokio nors koronaviruso, tinkamo transkripcijai infekcinės RNR (Kuo L. et al., 2000).
Susintetinti pilno dydžio infekcinę kDNR gigantiško (virusams) 30000 nukleotidų porų genomo dar ir turinčio nestabiles atkarpas – labai sudėtinga užduotis molekuliniams biologams. Dutūkstantaisiais šią užduotį išsprendė Ralfo Bariko grupė, naudodama virusus transmisinio gastroenterito (ransmissible gastroenteritis virus, TGEV) ir pelių hepatito (štamas MHV-A59), tuomet labiausiai ištirtus tarp koronavirusų (Yount В. et al., 2000; 2002). Jie surinko pilnas kDNR abiejų virusų, naudodami naują metodą, gavimo plazmidėse atskirų kDNR subklonų, apimančių visą viruso genomo. Kiekvienas klonas buvo sukonstruotas su unikaliomis flankuojančiomis jungiančiomis jungtimis, apsprendžiančiomis jų surinkimą tiktai su kaimyniniais kDNR subklonais, kas leido susiūti juos kartu in vitro ir gauti intaktinę infekuojančią kDNR konstrukciją, pilnai atitinkančią natyviai koronaviruso RNR plius-grandinei. Liguojant kDNR subklonus flankuojančios jungtys buvo pašalinamos, ir surinkimo pilno dydžio kDNR po to nelikdavo. Transkriptai, gauti iš koronaviruso pilno dydžio kDNR, pagalba elektroporacijos įvesdavo į permisyvines ląstelių linijas, ir jose prasidėdavo surinkimas pilnaverčių, infekcinių virusų dalelių (Yount В. et al., 2000; 2002). Bendra schema surinkimo KDNR TGEV klonų į pilno dydžio kDNR infekcinio RNR-viruso parodyta piešinyje 1.9. (žiūr. knygos 44 psl. http://rpmp.ru/book/38/COVID-19.pdf).
Pilnas genomas SARS-CoV Urbani buvo surinktas tuo pačiu būdu, šešių tarpinių subklonų pavidalu. Per unikalius restriktazės Bgl II saitus juos sujungė į pilno dydžio viruso kDNR, ligavo ir in vitro naudojo kaip matricą RNR transkripcijai su RNR-polimeraze. Gauti RNR-transkriptai buvo infekciniai, t. y. Bariko grupė pilnai atkūrė gamtinį kamieną SARS-CoV pagal jo nukleotidų seką (Yount В. et al., 2003). Iki sintetinės koronavirusologijos liko vienas žingsnis – reikėjo jau ne atkūrinėti gamtinius virusus, o kurti juos su naujomis savybėmis (21). Tačiau reikėjo suprasti masta S-baltymo modifikacijos ir kaip jas keisti plečiant koronaviruso specifiškumą organuose ir audiniuose tradicinio šeimininko ir plečiant diapazoną jo naujų šeimininkų. Tokie bandymai buvo atliekami su MHV. Šeimininkų diapazoną ir viruso specifiškumą mėgino išplėsti perjungiant nuo aukšto specifiškumo receptoriaus (atskiri biliariniai pelių glikoproteinai) į nespecifinį – heparinsulfatą (linijinis polisacharidas, atrastas visuose žinduolių audiniuose). Kas iš to išėjo, iš straipsnio neaišku. Bet laikai pasikeitė. Mirtina SARS epidemija nukreipė tyrėjų interesus nuo variacijų su S-baltymo MHV ir FIPV į S-baltymą, užtikrinantį specifiškumą pavojingesnių koronavirusų. Esmine problema tapo mechanizmas, pagal kurį jie gali įgyti gebėjimą pakeisti „šeimininką“, t. y. persiduoti iš kitų žinduolių žmogui ir po to plisti iš žmogaus žmogui (de Нааn С. et al., 2005) (22).
Nuorodos:
(18). Institutas buvo įsteigtas 1956 m. kaip Kinijos Mokslų akademijos mikrobiologijos laboratorija. 2015 m. sausio mėnesį prancūzų subrangovas iš Liono pastatyta pirmoji KLR BSL-4 apsaugos lygio laboratorija. Kontrakto kaina – 44 milijonai JAV dolerių. Darbuotojai buvo apmokyti BSL-4 apsaugos lygio laboratorijoje Galvestone, Techaso valstija (The Galveston National Laboratory in Galveston, Texas (US). (19). Tai pagrindinės mokslinės mokyklos, yra ir kitos. Pavyzdžiui, David Axelrod Institute, Wadsworth Center for Laboratories and Research, New York State Department of Health, Albany, New York 12201, 1 and Institute of Virology, Department of Infectious Diseases and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, and Institute of Biomembranes, Utrecht University, 3584 CL Utrecht, The Netherlands. (20). Deigin Y. Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy through the Lens of Gain-ofFunction Research, https://yurideigin.medium.com/lab-made-cov2-genealogy-throughthe-lens-of-gain-of-function-research-f96dd7413748 (kreipimosi data: 16.06.2021) – labai turininga mokslinė „esė“ apie gavimą koronaviruso chimerų gamtinių koronaviruso kamienų pagrindu. Šiame darbe Jurijus Daigin siūlo metodus nustatymo požymių žmogaus įsikišimo į vieusų genomą. (21). Kol kas dar ne „nuo nulio“! (22).Jurijus Daigin atkreipė dėmesį į tai, kad Ši Čženli vardas atsirado pirmą kartą šiame straipsnuje. Matyt, 2005 metais ji stažavosi vadovaujama Piterio Rotierio Utrechte (Faculty of Veterinary Medicine and Institute of Biomembranes, Utrecht University, The Netherlands). Šis institutas buvo nurodytas jos afiliacijos vieta.
Tęsinys: http://lebionka.blogspot.com/2022/01/kaip-mokslininkai-konstravo-korone.html
